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在萃取 DNA/RNA 時, 如何將 organic materials 去除呢? 最常用的, 便是 phenol/chloroform. 但是, 它是揮發性的溶劑, 又有著聞了總覺得會中毒的味道, 最重要的是, 吸取下層的水層時簡直是全身汗毛都站了起來.
記得以前大學在實驗室時, 第一次看學長進行這個步驟時, 全神貫注, 右手緊繃地拿著 pipette, 左手小心翼翼不敢稍有鬆懈地拿著 1.5 ml centrifuge tube, 仔細又動作輕微地吸取著下層, 只見下層一點一滴地減少, 在接近兩層的交界處時, 考驗功力的地方來了, 盡可能取到最大量又不會吸到有機層為最高指導原則, 說的簡單, 在貪與不貪間很難拿捏的恰到好處. 對於這個令人又愛又怕的步驟, 每個人有著各式各樣的傳家姿勢; 有的將 1.5 ml centrifuge tube 對著 燈光舉高高, 頭呈現 45度仰角, 利用光線讓眼睛看準該收手的時刻; 有的則是低著頭, 上半身呈現緊縮的狀態, 讓視線牢牢盯住下降的液面 ...... 而且由於緊張將硬不自然的用力, 又手常常會有著輕微的抖動. 對常進行核酸萃取的單位來說, 真是個傷眼, 傷神又傷身的實驗; 不小心沾吸到 chloroform, 還外加傷心 ......
後來有機會接觸到 "Phase Lock Gel (PLG)", 心中響起一陣歡呼, 這真是太好用了 ...... (淚)
圖片來源請參照這裡它的構造就像迷彩頭採血管 (SST), 在管中有著如蠟一般的白色物體, 經過離心後, 這個白塊會夾在含核酸的水層與有機層之間, 吸取水層時就不怕有機溶劑的偷渡囉! (見下圖所示)
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將核酸萃取純化的步驟在輕鬆愉快的心情下就能完成.
這項美妙的商品原本是 Eppendorf 的產品, 大概從去年開始, 變成 Fisher Scientific在賣. 根據不同的檢體量, Phase Lock Gel 有不同體積的選擇, DNA (Light) 或 RNA (Heavy) 也有自己專用的:
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在選擇體積時要注意, 因為在加入後 mix時管內需要空間. 曾經有一次我們忘了這個原則而買錯, 原本檢體就有 1 ml, 加入 chloroform 200 ul後, Phase Lock Gel 1.5 ml 管內空間不足, 每支檢體只得分成兩管做, 無形中增加實驗的麻煩. 另外還有一點要注意的是, 檢體量不要超過太多, 不然分離效果會變差, 就是離心後蠟塊形狀會有些許不完整, 有機層就容易有一些跑到上層來, 如果之後會再以 column純化的話, 就不需要太擔心.
後來 Qiagen也有出相同的商品, 叫 MaXtract Low and High Density, 我並沒有用過, 不過我想應該效果是差不多的, 再加上對於 Qiagen 家的商品品質一向都覺得很滿意 (是品質不是價錢喔~~~笑), 我相信是沒有問題的.
本部落格的第一篇文章, 就獻給近一兩年來在實驗室令我愛不釋手的好物~~ NanoDrop ND-1000.
圖片來源: 請參見
記得以前唸研究所時, 抽完 DNA後就是緊張的測濃度時間, 檢體往往是珍貴的, 特別是臨床來源的檢體, 如果沒抽好, 又不可能把病人再請回來再採檢一次, 因此, 往往是一次定生死 ...... 除了擔心品質不好外, 產量也是一大重點.
過去, 分光光度計常是實驗室的怪獸, 就是需要不算小的空間, 後來在體型上有漸漸朝著美而小的方向設計, 但是所需要的檢體量至少也需要 50 - 100 ul. 當檢體量不多時, 對於測濃度時所耗費的就會斤斤計較, 希望越少越好. 如果遇到機器不穩定或是濃度太稀測不準時, 我們只好欲哭無淚地重新稀釋 ...... 另外, 每個樣品間清洗 cuvette 所花的時間讓測濃度變成費時的一大步驟, 通常需要至少 2 - 3次水的清洗, 再加上一次酒精讓水快速蒸散, 最後再以吹氣設備將 cuvette 吹乾. 光這個清潔的步驟就要花上 3 -5 分鐘, 洗完了還是擔心 cuvette 沒清乾淨造成 sample carry-over, 又怕 cuvette 內有水分或酒精殘留.若是實驗室沒有吹吹的設備, 只得以甩乾的方式來代替, 可是, 石英 cuvette 往往所費不貲, 在甩乾的同時如果不小心失手 ...... 在石英破裂的同時, 學生跟助理還有老師大概也跟著心碎了吧 ...... (在下我就是有扼殺 cuvette的經驗, 所以了解那時心碎的感覺 ...... Orz )
NanoDrop ND-1000 的出現, 解決了許多上述的問題, 它有著下列幾項特點:
1. 體積小, 底部約佔 2/3 A4 面積 (需由電腦控制, 以 USB相連接 )
2. 測量體積小, 只需 1-2 ul
3. 線性範圍廣, 測量濃度區間為 2 - 3700 un/ul
4. Cuvette-free
5. 全波長掃描 220 - 750 nm
6. 測量時間約為 10秒/每個樣品
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將樣品置入樣品台後, 利用毛細現象拉成水柱測量濃度, 之後再花約 10 - 20 秒的時間以 Kimwipes 擦拭即可. 快速簡便.
也由於可接受濃度範圍廣, 通常稀釋 3 - 5 倍即可, 又因為所需體積很小量, 稀釋一次便可重複測 2 - 3次, 可解決機器不穩定時重測又需重新稀釋的困擾.
說了這麼多的優點, 到底測出來的濃度準不準呢? 就我的經驗來說, 測定 DNA/RNA 的 A260是準的, 曾經我們有同時比較 ND-1000 跟另一台 Ultrospec 2100 pro, 結果測出的濃度差不多, 但是在比較極端的濃度時, 兩台的 A280就有差異了, ND-1000 的 A260/280 比較歡樂 (就是純度看起來會比較好啦!), 至於誰的答案才是正確的, 這個我就不確定了 ......
那 ... 到底 ND-1000 有沒有缺點呢? 目前為止我認為的缺點只有兩個, 第一, 便是測過的檢體無法回收; 第二, 稀釋倍數無法輸給軟體, 就是測得的濃度需要自己再將稀釋倍數乘回來, 不過, 可以把資料匯入 excel 做計算, 其實也花不了多少時間.
後來, ND-1000 又有其他的兄弟姊妹, ND-3300 跟 ND-8000. 據說 ND-3300是利用螢光可以偵測濃度更低的檢體, 而 ND-8000則是可以同時測定 8個樣品. 我想, 除非實驗室家大業大, 不然應該不需要玩到這麼 "high through-put"吧! 如果真的做到這樣, 對助理或學生來說, 應該不是什麼好事吧 ......
如果想對 ND-1000 有更多的了解, 可以參考原廠網站, 還有 Demo Vedio 喔~~~
圖片來源請參照這裡
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