Ceramic Beads for Tissue Homogenization

前一陣子有個新的 project, 需從人類的軟組織中 extract genomic DNA, 而且, 檢體數還不少, 大約有三四百個檢體要做.
一下子來了這麼多檢體, 這時候人類想走捷徑的偷懶, 喔不, 是講求效率的天性又發揮了, 最後, 終於找到不貴又方便 , 又不會有檢體間污染的好工具, 那就是進行組織研磨的 ceramic bead.


在這裡, 我推薦兩個好用的牌子:

第一個就是大家耳熟能詳的 Roche, 產品名為 MagNA Lyser Green Beads.

圖片出自這裡
每一管中裝的是直徑為1.4mm的陶瓷珠, 藉由震盪來磨碎其中的組織. 而震盪的力道則是來自於搭配使用的 MagNA Lyser Instrument.

圖片出自這裡
根據不同組織的特性, 如:軟硬度或是結締組織的多寡,調整震盪的速度與時間.
它的優點是陶瓷珠已分別裝於每一獨立的管中, 使用超級方便, 對於 RNA 的萃取也是一項不錯的選擇. 缺點就是, 當步驟精簡越多, 所需付出的成本也越大, 幫需要進行的檢體量很大時, 就要稍微計算一下花費了.


第二個要介紹的是 Precellys Beads Kit.

圖片出自這裡
它們家其實有著各式大小以及不同材質的珠子以供不同研磨需求的使用者選擇.
不過由於使用 MagNA Lyser Green Beads在先, 因此我還是以 1.4mm ceramic bead來做實驗.
與 MagNA Lyser Green Beads相較, Precellys Beads感覺質地比較硬. 以 MagNA Lyser Green Beads研磨後珠子的碎屑比較多, 所以用 Precellys Beads來研磨時, 研磨時間可減少約5秒, 震盪速度也可減少 500rmp左右.

Precellys Beads 有個很大的優點在於包裝選擇比較多, 除了已填裝好的外, 也有散裝可以買, 只要另外自備適當的旋蓋管, 就可以自行填入陶瓷珠, 價錢上也會迷人很多.
另外, 先前提過它有多種不同大小材質, 自己可以依照實驗檢體的特性, 將不同珠子自由搭配, 讓研磨效果達到完美.

Precellys 也有研磨機, 不過我沒有用過.
圖片出自這裡

如要利用 ceramic beads 來進行核酸萃取, 一開始會需要花一些時間找到最佳的研磨轉速與時間, 特別是脆弱的 RNA, 而且每一種組織最好都先測試看看. 雖然會花一些功夫, 但條件試出來後, 接下來就是快樂的 High-Throughput Extraction.

傳說中上帝不適合在學校當指導教授的原因 (引用)

以下, 是一篇引用自研究所完全求生手冊 的文章, 有智慧的幽默 ......

一、只有一本著作，而且主要內容是由人代筆

二、這本著作沒有引用參考文獻

三、因為偷吃食物，就開除了最早跟祂作研究的兩位研究生

四、會養蛇嚇學生

五、有人說祂常不來上課，都請兒子代課

六、有以大水銷毀大量實驗成品的紀錄

七、當發現實驗樣本的數據不良，會刪除極端值不良樣本

八、常常不出現在教室，喜歡到山頂上戶外教學

九、雖然祂的規則只有十條，但是大部份的學生都沒辦法遵守

十、沒有留下聯絡電話，研究生常找不到人、唯一知道祂聯絡管道的博士班學長，據說後來也失蹤了。

原文出處請點此.

個人覺得最有趣的是第二, 第六及第七點.

舉凡從研究的起源, 實驗設計的方法以及最後結果討論的部分, 幾乎都有先前研究結果的參與, 然後再加以衍生. 所以, 只要不是自己創新的部分, 都要說明引用出處. 以前在學校時的 seminar, 就有同學報告的 powerpoint 上出現一張極為漂亮的圖作為他的開場介紹, 台下有老師提出了一個問題: "這張圖是你畫的嗎?" "不是." "那怎麼沒有標明出處?" 可見引用與剽竊必須分界得很清楚. 而且, 之後別人在閱讀某 paper或論文時, 根據 reference 也可以追溯歷史.

至於第六七點有點像, 每每發現結果不如預期, 甚至也許是與假設背道而馳時, 都很想把結果銷毀,最好老師不要發現; 或是有樣品的數值是所謂的 outlier又查不出原因時, 就會問統計專家說我可以把這個檢體踢除不計嗎? 雖然, 有這樣的想法是人之常情, 特別是學生等著畢業開創美好人生時, 就會有這種念頭 ...... 但是, 憑良心說, 對於一個實驗室的發展來看, "traceable" 是非常非常重要的, 無論是實驗方法, 實驗紀錄, 存放位置到檢體資料都必須記載得一清二處, 在人員交替進行工作交接時, 更是一大重要環節, 否則, 一段時間後就會有幽靈 data 或是幽靈檢體出現, 想丟又捨不得, 不丟又不敢用 ...... 實驗室工作最害怕被追問過去的"回憶", "你記不記得大概一兩年前曾經訂過 XXX" "ㄟ...... 你記不記得之前有一個檢體 XXX", 這個時候就會很希望腦袋可以像電腦硬碟一樣做"備份".

一直有一個疑問, 如果有人是很虔誠的基督徒, 做生物方面的研究要如何說服自己? 我一直無法接受所謂世界是神無中生有創造的說法, 因為這跟我的"科學"相牴觸. 曾經有同事跟我說: "我有認識的朋友就是這樣啊! 他們是虔誠的基督徒, 從事生物研究只是為了證明這些研究的想法都是假的." 嗯, 我只能說同一件是大家的出發點都不一樣, 我希望我可以一直都用科學的角度看事情, 有結果有真相.

Is Metastatic Dissemination of Cancer Cells A Late-Stage Event?

Seeding and Propagation of Untransformed Mouse Mammary Cells in the Lung
Science 321 (5897): 1841-1844


癌症的發生是一連串的過程:


影片來源: http://klemkelab.ucsd.edu/research/cancer.html


癌症的轉移一般被認為是在癌症發展後期才會出現的, 不過近年來已有許多研究指出, 其實在早期的過程中, 細胞的散佈便已發生, 甚至可能在 primary cancer 尚未被發現時, 癌細胞就悄悄地移動出去了 (Y Husemann et al., 2008).

在這篇 2008年9月發表在 Science 的文章中, K Podsypanina 等人利用了 transgenic mice model 以及 tetracycline regulation (Tet-On) 的實驗進行探討, 其結果大致有下列幾點:

1. 經由實驗模式將 oncogenes活化後, 可促使正常乳腺細胞 (mammary cells) 轉變成腫瘤細胞, 並具有惡性 (malignant) 腫瘤的特性, 如: 轉移在異地 (ectopic sites) 生長.

2. 帶有 transgenic oncogenes 的正常 mammary cells, 即使細胞仍是正常狀態, 便可以在 ectopic sites 存活下來; 之後一旦 oncogenes 被啟動, 在該處的 mammary cells 便會形成腫瘤.

3. 就算是不具有 transgenic oncogenes 的 mammary cells 也可以在肺部存活及生長, 而且繁殖的細胞仍然具有乳腺的型態及構造.

4. 由於實驗設計是以靜脈注射(tail vein) 的方式將 mammary cells 打入 recipient mice, 略過了癌細胞轉移發生的早期步驟, 如: intravasation, 因此並沒有探討 oncogenes 活化以及細胞變性 (cellular transformation)對於這些前期過程的影響.; 但是對於後期步驟這些似乎都不是主要的必要條件.

這篇研究對於癌症轉移提供了新的思考方向.

另外有兩點也是值得探討的:

1. 實驗的 recipient mice 是免疫不全的個體, 與一般正常實際發生狀況不盡符合.

2. 本篇並沒有討論到 transplanted cells 是否為 stem cells.

p.s. 以上僅個人閱讀心得, 如有任何勘誤, 敬請指教討論.

實驗室必備 - 小烏龜 (迷你微量離心機)

這次要推薦的其實沒啥特別之處, 純粹就是犯了"外貌協會"的毛病.

小烏龜, 談不上什麼實驗室了不起的東西, 雖說沒什麼, 卻是實驗室的基本配備, 只要有做實驗, 一定會用到.只是, 對於它的這個稱號我是有些小小的意見, 沒事幹嘛叫個做實驗的人最怕的動物呢? (就是槓龜囉!) 上次我不過心血來潮, 畫了一隻自己覺得還不賴的烏龜圖, 貼在筆筒上, 隔壁的同事就說別朝向她, 就是怕實驗失敗 ...... 雖說是做科學的, 但是當實驗一直槓龜連連時, 還是想求神問卜, 到底是哪裡出了問題. 究竟是該換試劑呢? 還是挑的日子不好, 適逢月破大凶日呢? 不然,還是操作的人不對, 就是犯沖呢? 曾經有同事在一連串不順的 PCR問題時就說: 好啦! 一定是我的問題, 把我的手剁掉好了. 雖然只是個助理, 但是, 值錢的就是咱們這雙手啊! 親愛的各位, 一定要愛惜自己的手喔!

哎呀! 離題了. 言歸正傳,今天要推薦的這個小烏龜,推薦理由只有一個,就是外型好看.

圖片引用自: 這裡

推薦的是右邊的白色, 對於女性同胞來說, 有沒有覺得感同身受的喜愛呢? 當初, 老闆 (男性)在選的時候, 就是不想要一般的藍或黑, 覺得跟實驗室的色調不搭, 所以特地選了這款清新的顏色, 也幸虧老闆的慧眼, 讓我們有一台與眾不同的小烏龜.

不過, 它真的就是外型突出而已, 畢竟, 小烏龜只是讓管内東西小小地離至管底而已, 沒有太特別的功用. 不僅如此, 上天是公平的, 就像漂亮的人往往內心有缺陷一樣, 實驗室當時一口氣買了三四台,兩三年間已經有兩台送修過了~~~ 要嘛是完全不會轉, 要嘛是零件斷裂, 以前待過的實驗室, 從來沒有小烏龜壞掉的紀錄. 只能說, 東西通常是有一好沒有兩好......

保護眼睛的產品 - Phase Lock Gel

在萃取 DNA/RNA 時, 如何將 organic materials 去除呢? 最常用的, 便是 phenol/chloroform. 但是, 它是揮發性的溶劑, 又有著聞了總覺得會中毒的味道, 最重要的是, 吸取下層的水層時簡直是全身汗毛都站了起來.

記得以前大學在實驗室時, 第一次看學長進行這個步驟時, 全神貫注, 右手緊繃地拿著 pipette, 左手小心翼翼不敢稍有鬆懈地拿著 1.5 ml centrifuge tube, 仔細又動作輕微地吸取著下層, 只見下層一點一滴地減少, 在接近兩層的交界處時, 考驗功力的地方來了, 盡可能取到最大量又不會吸到有機層為最高指導原則, 說的簡單, 在貪與不貪間很難拿捏的恰到好處. 對於這個令人又愛又怕的步驟, 每個人有著各式各樣的傳家姿勢; 有的將 1.5 ml centrifuge tube 對著 燈光舉高高, 頭呈現 45度仰角, 利用光線讓眼睛看準該收手的時刻; 有的則是低著頭, 上半身呈現緊縮的狀態, 讓視線牢牢盯住下降的液面 ...... 而且由於緊張將硬不自然的用力, 又手常常會有著輕微的抖動. 對常進行核酸萃取的單位來說, 真是個傷眼, 傷神又傷身的實驗; 不小心沾吸到 chloroform, 還外加傷心 ......

後來有機會接觸到 "Phase Lock Gel (PLG)", 心中響起一陣歡呼, 這真是太好用了 ...... (淚)

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它的構造就像迷彩頭採血管 (SST), 在管中有著如蠟一般的白色物體, 經過離心後, 這個白塊會夾在含核酸的水層與有機層之間, 吸取水層時就不怕有機溶劑的偷渡囉! (見下圖所示)


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將核酸萃取純化的步驟在輕鬆愉快的心情下就能完成.

這項美妙的商品原本是 Eppendorf 的產品, 大概從去年開始, 變成 Fisher Scientific在賣. 根據不同的檢體量, Phase Lock Gel 有不同體積的選擇, DNA (Light) 或 RNA (Heavy) 也有自己專用的:

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在選擇體積時要注意, 因為在加入後 mix時管內需要空間. 曾經有一次我們忘了這個原則而買錯, 原本檢體就有 1 ml, 加入 chloroform 200 ul後, Phase Lock Gel 1.5 ml 管內空間不足, 每支檢體只得分成兩管做, 無形中增加實驗的麻煩. 另外還有一點要注意的是, 檢體量不要超過太多, 不然分離效果會變差, 就是離心後蠟塊形狀會有些許不完整, 有機層就容易有一些跑到上層來, 如果之後會再以 column純化的話, 就不需要太擔心.

後來 Qiagen也有出相同的商品, 叫 MaXtract Low and High Density, 我並沒有用過, 不過我想應該效果是差不多的, 再加上對於 Qiagen 家的商品品質一向都覺得很滿意 (是品質不是價錢喔~~~笑), 我相信是沒有問題的.